口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease手机成人游戏，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，FMDV)引起猪、牛、羊等主要牲畜和野生偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度宣战性传染病。该病传播赶快、发病率高，我国次序为一类动物传染病。该病的暴发和流行严重危害牲畜的分娩力和畜产物性量，影响发病地区的经济发展、海外商业和社会巩固。因此，100多年来该病一直是全全国兽医学家包涵的焦点。

海外兽医卫生组织次序FMD疫苗效劳的有用性评估必须在猪和牛等靶动物上进行。但该关键存在非免疫的猪、牛等皑皑动物源流困难、历练资本高、难以操作等一系列问题。因此，FMDV践诺动物模子的商酌越来越受到东谈主们的包涵。20世纪30年代，商酌者发现一些FMDV接种豚鼠后能引起和猪、牛感染同样的临床症状，在趾部、舌面和唇部出现水泡性组织病变，至此，东谈主们将豚鼠算作FMDV商酌的一种模子动物，用于病毒致病性及疫苗免疫效劳的评估[1–3]。然而，到当今为止，豚鼠遗传学和免疫系统等方面还不系数明晰，且一些FMDV毒株不易在豚鼠体内引起引发性病变而受到应用的适度[4]。比较豚鼠，频年来的商酌发现，一些FMDV(C1 C-S8c1、SAT1、Asia1 Shamir和A/Arg/01)对C57BL/6小鼠辱骂常敏锐的，它们均可导致该品系小鼠出现典型的临床症状和示寂[4–6]，而一些对C57BL/6小鼠不敏锐的FMDV，如O/Jincheon/SKR/2014、A/Malaysia/97和Asia1/MOG/2005，通过在C57BL/6小鼠和原代细胞(腾达山羊舌上皮细胞ZZ-R)的屡次合乎传代，也能引起C57BL/6小鼠发病和示寂[7]。自此，C57BL/6小鼠也徐徐被算作一种践诺动物模子，用于FMDV疫苗效劳和致病性等的商酌[8–9]。但到当今为止，关系FMDV株感染C57BL/6小鼠动物模子的商酌仍鲜有报谈。因此，本商酌通过FMDV在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞的轮回传代，试图建立FMDV的践诺感染模子，从而为FMDV致病分子机制和新式疫苗的开辟奠定基础。

1 材料和关键 1.1 病毒、细胞、动物

不成引起C57BL/6小鼠出现临床症状的FMDV O/HK/CHA/99第4代乳鼠毒(O/HK/CHA/99 MF4)和胎猪肾原代细胞FPK由中国农业科学院兰州兽医商酌所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队分离保存。8周龄C57BL/6小鼠购自中国农业科学院兰州兽医商酌所动物厂。

1.2 FMDV的传代

FMDV O/HK/CHA/99 MF4鼠毒12000 r/min离心10 min，取上清后脚掌皮下接种8周龄C57BL/6小鼠(n=10)，0.1 mL/只。接种48 h后小鼠眼眶采血、分离血清并过滤。过滤后的系数血清接种单层长满的FPK细胞。当约95%以上FPK细胞出现细胞变圆时，网络病变细胞，反复冻融3次后，12000 r/min离心10 min，取上清以1/10体积的病毒接种量再次接种至单层长满的FPK细胞，约95%以上FPK细胞出现细胞病变后，如上网络病毒，再接种C57BL/6小鼠进行轮回传代。C57BL/6小鼠和FPK细胞的轮回传代重复9次(传代治服见图 1)。其中将病毒在FPK细胞上第2次传代网络的病毒象征为轮回的代次(Cn)，如第5轮轮回在FPK细胞上第2次传代的病毒，象征为O/HK/CHA/99 MF4C5。通盘轮回传代经过中同期建树对照小鼠，接种PBS，0.1 mL/只。为了检测FMDV在未出现临床症状小鼠体内的复制情况，将小鼠体内分离的血液用RNAasy Mini Kit索要细胞总RNA，用FMDV 3D特异的引物(RQ1 CAAACCTGTGATGGCTTCGA，RQ3 CCGGTAC TCGTCA/TGGTCCA)和探针(FAM-CTCTCCTTT GCACGCCGTGGGAC-BHQ) RT-PCR及时荧光定量检测接种的FMDV在小鼠体内RNA的拷贝数。

国产探花 1.3 FMDV蚀斑表型和一步滋长弧线

为了比较分析轮回传代引发C57BL/6小鼠出现临床症状和示寂的FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5和传代前病毒O/HK/CHA/99 MF4的生物学特质，咱们对这2个病毒的蚀斑表型和一步滋长弧线进行分析。将O/HK/CHA/99 MF4C5和O/HK/CHA/99 MF4两个FMDV远离作10倍系列稀释，然后将不同稀释度病毒按照文件报谈的关键作念蚀斑表型分析，并筹商每个病毒的噬斑变成单元(PFU)[10]。将106 PFU/mL的两病毒远离接种到长满的单层BHK-21细胞(25 mL培养瓶，约106个细胞)，吸附1 h后弃病毒液，用PBS洗3次，加5 mL MEM基础培养基，并置于CO2培养箱连续培养。于接种后4、8、12、16 h远离收取感染细胞，反复冻融2次后在BHK-21单层细胞上按照旧例关键测定病毒的滴度(PFU/mL)，并画图病毒的一步滋长弧线。

1.4 FMDV对乳鼠的致病性

为了检测FMDV O/HK/CHA/99 MF4和O/HK/CHA/99 MF4C5对乳鼠的致病性，将两病毒用PBS缓冲液(pH=7.6)进行10倍系列稀释，取10–4–10–8稀释度的病毒液皮下接种2日龄乳鼠，0.2 mL/只，每个稀释度接种4只，设2个空缺对照。接种后逐日不雅察乳鼠的发病和示寂情况，纠合不雅察1周，并记载，用Reed-munch法筹商病毒对乳鼠的LD50。

1.5 FMDV对C57BL/6小鼠的致病性

为了检测传代病毒O/HK/CHA/99 MF4C5和O/HK/CHA/99 MF4C9对C57BL/6小鼠的致病性，咱们将两病毒用PBS缓冲液(pH=7.6)进行10倍系列稀释，取10–1–10–5稀释度远离脚后掌皮下接种8周龄C57BL/6小鼠，每个稀释度接种5只，0.1 mL/只，对照小鼠接种PBS。纠合不雅察7 d，字据小鼠的发病情况，用Reed-Munch法筹商两FMDV对C57BL/6小鼠的LD50。

1.6 FMDV基因组全序列的测定和编码氨基酸的比对分析

为了比较分析轮回传代经过中FMDV编码氨基酸的互异，网络不成引起C57BL/6小鼠出现临床症状的突变株(O/HK/CHA/99 MF4和O/HK/ CHA/99 MF4C3)以及致C57BL/6小鼠出现临床症状和示寂的FMDV(O/HK/CHA/99 MF4C5和O/ HK/CHA/99 MF4C9)，用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)索要细胞总RNA，然后用合成的引物(表 1)对其进行RT-PCR，扩增每个病毒5个重复的DNA片断。扩增片断经凝胶纯化回收后送西安奥科生物期间有限公司进行序列测定。测定的病毒全基因序列用软件MegAlign比较分析。

2 效果和分析 2.1 FMDV的传代

FMDV O/HK/CHA/99 MF4前3轮轮回传代接种的C57BL/6小鼠，在48 h内看不到任何判辨的精神千里郁、举止迟缓、毛发赠送、通顺失调的临床症状和示寂，但及时荧光定量的效果标明接种的FMDV在小鼠体内进行了有用地复制。轮回传代至第4轮时，在48 h内有3只小鼠出现精神千里郁、举止迟缓、毛发赠送、通顺失调等症状，传至第5轮时，在48 h内，1/2以上的小鼠出现不同进度的临床症状，且有1只小鼠示寂。连续轮回传代至第9轮，48 h内一谈接种小鼠均出现典型的临床症状，并有2只小鼠发生示寂，且第1只小鼠出现示寂的时刻比第5轮轮回中出现示寂的时刻裁汰了10 h (表 2)。而系数接种PBS的小鼠在通盘践诺经过中未出现任何FMDV的临床症状和示寂。这些效果标明对C57BL/6小鼠不敏锐的FMDV，不错通过在体内和体外的屡次轮回传代引起小鼠出现典型FMD临床症状和示寂，况兼跟着传代次数的加多，FMDV对小鼠的致病力也徐徐增强。

2.2 蚀斑表型和一步滋长弧线

用旧例关键远离对FMDV O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5进行了蚀斑表型和一步滋长弧线分析。效果标明，合乎前和合乎后病毒FMDV均可在BHK-21细胞上变成蚀斑，且蚀斑格局大小议论(图 2-A)。一步滋长弧线也标明2个病毒FMDV和BHK-21细胞上具有同样的复制才气。评释FMDV O/HK/CHA/99 MF4通过在体内和体外的轮回合乎并莫得编削其蚀斑表型和病毒的复制特质。

2.3 FMDV对乳鼠的致病性

将FMDV O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5不同稀释度病毒远离接种2日龄乳鼠，其中FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5 10–3至10–7接种的乳鼠在40 h内一谈示寂，而接种FMDV O/HK/CHA/99 MF4 10–3至10–6的小鼠在接种后48 h内一谈示寂。剩余乳鼠和对照乳鼠纠合不雅察1周均未出现任何FMD临床症状和示寂。统计乳鼠的示寂情况，筹商O/HK/CHA/99 MF4和FMDV O/HK/CHA/99 MF4C5对乳鼠的LD50，远离为106.5和107.5。效果评释FMDV O/HK/CHA/99 MF4经体内和体外轮回传代后，对乳鼠的致病力判辨增强，这可能是传代合乎的FMDV致C57BL/6小鼠出现临床症状和示寂的原因。

2.4 FMDV对C57BL/6小鼠的致病性

登第轮回合乎传代的第5和第9轮FMDV，检测其对C57BL/6小鼠的致病性。效果测得合乎5轮和9轮后的FMDV对C57BL/6小鼠的LD50远离为102.8和105.1，标明加多FMDV在小鼠和原代细胞中的轮回传代次数，大要增强FMDV对C57BL/6小鼠的致病力。两病毒接种C57BL/6小鼠后示寂情况见图 3。

2.5 FMDV全序的测定和编码氨基酸的比对分析

轮回传代前和轮回合乎后第3、5和9代FMDV进行核苷酸序列的测定，效果标明第3代病毒发生2个核苷酸(VP3 C123T，2C C278T)的突变，第5代病毒发生了6个核苷酸的突变(VP4 G189A，VP2 C309T，VP3 C123T+C294T，VP1 G37A+C168G，2C C278T)，第9代FMDV发生了7个核苷酸的突变(VP4 G189A，VP2 C309T，VP3 C123T+C294T，VP1 G37A+C168G，2C C278T)。愚弄MegAlign分子生物学软件对测定FMDV的编码氨基酸进行比对分析，效果标明第3代病毒发生了1个氨基酸(2C A93T)的突变，第5代和第9代病毒均获取了2个氨基酸的突变(VP1 A13T和2C A93T)。传代病毒核苷酸和氨基酸的变化治服见表 3。轮回传代病毒核酸的变化主要发生在结构卵白VP4、VP2、VP3、VP1和2C区域，而氨基酸的变化仅发生在VP1和2C卵白上。这些氨基酸的变化是否导致FMDV对小鼠致病力的增强有待进一步商酌。

3 盘问

践诺动物模子在各式病毒疫苗的商酌中具有贫瘠的作用，愚弄动物模子可对疫苗的安全性、免疫原性以及保护效劳进行评估。因此，寻求一种经济、浅易、操作轻视和源流敷裕的FMDV动物模子备受商酌者的包涵。关于FMDV来说，除豚鼠和乳鼠动物模子外[5–6]，C57BL/6小鼠模子一直未能建立。揣度可能是因为很多的FMDV株不成引起C57BL/6小鼠发病[5–6]。直到2016年，韩国粹者发现一些不引起C57BL/6小鼠发病的FMDV (O Jincheon/SKR/2014、A Malaysia 97和Asia1 MOG/2005)，通过在C57BL/6小鼠体内(1次)+胎腾达山羊舌上皮细胞(ZZ-R)传代(2次)，共5轮轮回传代后，3个病毒均可引起C57BL/6小鼠出现典型的FMDV临床症状和示寂，但其机制仍不明晰。另外他们也发现C57BL/6模子动物对FMDV疫苗效劳的评价效果与在靶动物上取得的效果一致。因此，他们觉得应用C57BL/6小鼠不错有用地评估FMDV疫苗的效劳[7]。

为了在本践诺室告捷建立FMDV的C57BL/6小鼠模子，用于低资本、轻视、有用评估FMD疫苗的效劳以及一些病毒致病机制的探索，本商酌登第一株不引起C57BL/6小鼠发病的FMDV O/HK/CHA/99的第4代乳鼠毒(O/HK/CHA/99 MF4)，在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞之间轮回合乎传代。效果咱们告捷获取一株大要引起C57BL/6小鼠发病和示寂的FMDV突变株。该突变株跟着传代次数的加多，对小鼠的致病力也徐徐增强(如比较第5轮传代病毒，第9轮传代病毒对C57BL/6小鼠的LD50加多了约100倍)。咱们的效果评释，对C57BL/6小鼠不敏锐的FMDV，不错通过在C57BL/6小鼠体内和体外细胞的轮回传代而引起C57BL/6小鼠发病和示寂，且跟着传代次数的加多，病毒的毒力也徐徐增强。但传代FMDV对C57BL/6小鼠致病力的增强与病毒在细胞上的复制莫得径直的联系性。

为了改日揭示传代前和传代后FMDV对C57BL/6致病性互异的分子机制，咱们对传代前和传代后第3、5和9代病毒的编码氨基酸进行了比对分析，发现第3轮传代病毒获取1个氨基酸的突变(2C A93T)，第5轮和第9轮病毒均获取2个氨基酸(VP1 A13T和2C A93T)的突变。这与韩国粹者的报谈同样，O/Jincheon/SKR/2014、A/Malaysia/97经过5轮轮回传代也获取了多个氨基酸的突变，但Asia1 MOG/2005经过5轮轮回传代只发生了1个核苷酸的变化，莫得氨基酸的突变[7]。但于今为止，无论是韩国粹者仍是本商酌，关于传代病毒致病性发生编削的机制仍不明晰，是否由于传代经过中获取氨基酸突变所致，仍是可能存在其他未知的机制，有待改日进一步的商酌。

本商酌通过在C57BL/6小鼠和FPK原代细胞的多轮轮回传代，告捷建立了FMDV的C57BL/6小鼠模子手机成人游戏，为改日FMD疫苗效劳的评估和病毒致病机制的商酌奠定了基础。